稀释法测定最小抑菌浓度（MIC）是一项有效评估抗菌剂抑制微生物生长能力的实验技术，主要包括微量稀释法和常量肉汤稀释法两种方式。琼脂稀释法因其操作简便、成本低，以及适合高通量筛选而受到广泛应用，尤其适合于自动化操作和精确控制药物浓度。而肉汤稀释法则直观且易于操作，适用于实验室规模的测试，并可根据需要灵活调整药物浓度和培养基的体积。

琼脂稀释法

1. 原理 本试验采用琼脂稀释法，将不同浓度的抗菌剂混合溶解在琼脂培养基中，然后点种细菌，通过观察细菌的生长与否，确定抗（抑）菌物质对试验菌生长的最低抑制浓度，即最小抑菌浓度（MIC）。该方法特别适用于不溶性抗（抑）菌产品。

2. 操作步骤 （1）抗（抑）菌溶液的配制：在无菌条件下取5ml或5g（固体研磨后）样品，放入45ml灭菌的磷酸缓冲液中，充分震荡以溶解，制成10%的均匀溶液或悬液。 （2）含抗菌剂培养基的制备：将10%的抗（抑）菌溶液或悬液用PBS进行系列二倍稀释，制备不同浓度的受试液，然后置于45℃至50℃水浴中恒温备用。 （3）双倍浓度培养基的制备：称取76g的MH琼脂培养基，溶解于1000ml水中，并加热至沸腾完全溶解；然后在121℃下压力蒸汽灭菌15分钟，置于45℃至50℃水浴中备用。此培养基用于稀释抗（抑）菌溶液或悬液。 （4）含抗（抑）菌液培养基的制作：将10ml系列稀释的抗菌液加入平皿中，随即加入10ml在水浴中预热的双倍MH琼脂培养基，边加边轻摇平盘，以保证抗（抑）菌液与培养基充分混匀，待凝固后备用。 （5）接种细菌：用加样器取1μl至2μl（约含菌量为107cfu/ml）菌悬液点种于含抗（抑）菌液培养基的平皿中，接种后产生的菌液圈直径约为5mm至8mm（每个点的菌量约为104cfu）。 （6）接种对照：采用相同方法接种不含抗（抑）菌成分的MH琼脂平板，以作为阳性对照。 （7）培养与观察：将接种后的平板置于35℃的培养箱中，倒置培养18小时至24小时，观察结果。

3. 结果评判 当菌落生长被完全抑制的最低抗（抑）菌液浓度即为该样品对受试菌的MIC，单一菌落的生长可忽略不计。

营养肉汤稀释法

1. 原理 本实验将不同浓度的抗菌剂混合在营养肉汤培养基中，并接种细菌，通过观察细菌是否生长，来确定抗（抑）菌剂抑制受试菌生长的最低浓度即为最小抑菌浓度（MIC）。该方法适用于可溶性抗（抑）菌产品。

2. 操作步骤（1）制备金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的悬液。 （2）配置含抗菌剂的培养基：将抗（抑）菌溶液用蒸馏水进行系列对倍稀释，取各稀释度受试液25ml加入到含25ml双倍浓度营养肉汤的试管中。 （3）接种：取0.1ml菌悬液（约含菌量为108cfu/ml）接种于含抗（抑）菌剂的营养肉汤的试管，作为试验组样本。 （4）阳性对照组：以同样方法接种不含抗（抑）菌剂的营养肉汤试管。 （5）阴性对照组：取2支含营养肉汤的试管，作为阴性对照样本。 （6）培养：将试验组样本、阳性对照组及阴性对照组置于37℃培养箱中，培养48小时，观察结果。 （7）活菌计数：试验过程中应对试验用菌悬液进行活菌计数，其有效浓度应为5×105cfu/ml至5×106cfu/ml。

3. 结果评判 当阳性对照管中有细菌生长（混浊），阴性对照管中没有细菌生长（透明），且试验用菌悬液的有效浓度在5×105cfu/ml到5×106cfu/ml时，试验组中无细菌生长的最高稀释度所对应的抗（抑）菌剂浓度，即为该样品对受试菌的MIC。

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